ATAC-seq（染色質轉座酶可及性測序）是一種高效解析染色質開放區域的技術，通過Tn5轉座酶靶向切割松散染色質并標記DNA，結合高通量測序揭示基因調控元件的位置與活性，在植物生理研究中也被廣泛應用。例如，ATAC-seq聯合RNA-seq和Ribo-seq，揭示茶樹通過染色質重塑協同轉錄與翻譯適應低溫的分子策略；此外，該技術還用于擬南芥光信號響應研究，揭示BAF60蛋白通過競爭結合開放染色質區域調控光形態建成的分子機制等。

本次為各位老師帶來華中農業大學鄧秀新教授團隊在Plant Journal中發表的研究論文，題目為“Adventitious embryonic causal gene FhRWP?regulates multiple developmental phenotypes in citrus reproduction”，該文章利用ATAC-seq和轉錄組技術，探究了柑橘中無性繁殖現象——不定胚發生的機制。百邁客生物為該研究提供了ATAC-seq測序服務。

研究背景

植物的再生和發育是一個關鍵的過程，涉及從組織、器官、愈傷組織甚至具有多能性或多能性的單個細胞中重建整個植物，并通過復雜的調控網絡進行細胞命運的轉化，深入了解植物的再生和發育，對于設計提高作物再生效率的分子工具至關重要。

不定胚直接從獲得胚性命運的珠心組織細胞亞群發育而來，作為有性生殖的替代品，在柑橘和芒果等少數植物中已有報道，因此，對不定胚胎發生的研究可以為植物再生和發育的遺傳機制提供獨特的視角；由于缺乏合適的遺傳系統來探索潛在機制，我們對不定胚和再生之間關系的理解非常有限，在植物再生工程應用中，目前已有部分基因被鑒定并用于促進植物再生，從而克服了與物種相關的局限性，FhRWP的功能和不定胚的調節網絡仍在很大程度上未被了解，已有研究提出，染色質重塑復合體亞基?被認為能夠誘導FhRWP的高表達，該研究通過整合轉錄組與染色質開放圖景數據闡明了FhRWP表達與其表觀遺傳調控之間的調控關系。

材料及方法

材料：單胚基因型和多胚基因型山橘胚珠、腋芽、幼葉及胚源性愈傷組織等；

方法：ATAC+轉錄組+重測序+激素檢測等

研究結果

1.多胚山橘的開放性染色質

為了揭示來自珠粒細胞的外胚的重編程模式，作者采用ATAC-seq分析了多胚（PO）及單胚（MO）基因型山橘后胚的胚珠的全基因組染色質可及性，結果表明，PO特異性開放染色質區域（ACRs）基因參與了次級代謝過程、生長正調控、細胞分化和正向調控細胞生長。

先前的研究表明，一個顯性基因FhRWP決定了與微型倒重復轉座因子（MITE）插入相關的不定胚胎的啟動，在PO基因型中FhRWP的啟動子區中鑒定到了特異性ACR，而Mo基因型中不含ACR，該ACR與FhRWP啟動子區域的MITE序列重疊，即MITE序列被FhARID1蛋白結合，這可能是染色質重塑復合體的一個亞基，這些結果表明，FhRWP是可及染色質的決定因素，參與不定胚胎發育，與MITE的插入有關。

山橘基因組中與組織再生和體細胞胚胎發生相關的hub基因，研究結果表明，與組織再生和體細胞胚胎發生相關的hub基因，有12個ACRs特異性轉錄因子在PO和Mo基因型柑橘品種之間存在差異表達，WUSCHEL（WUS）基因是干細胞維持的關鍵調控因子，在PO基因型柑橘中表達上調。FhKRP7kip相關蛋白（KRP）基因編碼一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI），是細胞分裂的負調控因子。而FhKRP在PO基因型中下調了0.59倍。總的來說，分析顯示，多胚胎基因型可能具有更大的染色質可及性區域，促進植物重編程通路相關基因來調控不定胚的形成。

2.FhRWP基因的基因編輯結果展示其在不定胚發生中的作用

FhRWP基因在胚囊中的表達是特異性和短暫的，可以從受精前7天開始追蹤，直到后10天，作者采用RNAi方法構建了6個干擾系，發現FhRWP在6個干擾系中的表達量相比PO系顯著降低，但顯著高于Mo基因型，且FhRWP表達量降低后不定胚數量也都減少了，這些結果提示，受FhRWP控制的不定胚表型可能與基因表達的劑量效應有關。

作者之前的研究顯示的雜合子插入MITE啟動子區域和一個FhRWP的CDS序列區域SNP（C-G），導致這個基因的分裂成兩個單倍型，M等位基因（MITE）和P等位基因（沒有MITE）。根據Mo和PO腋芽的轉錄組結果，作者發現PO中RWP轉錄本高表達P等位基因，而Mo中M等位基因表達較小，于是作者構建了CRISPR/Cas9載體，以敲除FhRWP，結果表明，插入MITE可以通過促進含有MITE的P等位基因的表達，同時減少不插入MITE的M等位基因的表達，從而改變該基因的表達模式。雖然FhRWP在ko-47-1和ko-47-2中的FhRWP的表達下降到與Mo一致的水平，但P等位基因突變導致的過早終止導致了FhRWP功能的喪失，因此，ko-47-1和ko-47-2植株表現出新的表型，如生長遲緩和花芽分化失敗。

此外，對對照和轉基因株系的腋芽進行差異表達分析發現，這些基因在確定植物器官特性和植物器官形成等過程中存在明顯的富集，與開花相關的FT/TFL1基因家族的表達也存在差異；此外，有研究表明CEN促進了芽的休眠作用，通過酵母單雜交，發現FhRWP直接調控FhCEN的啟動子區域。

柑橘胚愈傷組織的誘導具有明顯的基因型依賴性，作者在Mo基因型山橘中過表達FhRWP的P等位基因CDS，檢測到GFP的植株胚胎愈傷組織增長迅速。qRT-PCR顯示FhRWP表達高度上調，細胞分裂素、ABA和水楊酸激素水平有顯著變化，而生長素和赤霉素水平則無顯著性差異，FhRWP的過表達有助于Mo基因型山橘莖段上胚胎愈傷組織的形成。轉錄組結果顯示，WUS和CLV1等再生途徑相關的低豐度基因表達上調，在OE-FhRWP愈傷組織中，WUS與CLV1表達量增加，與激素分析結果一致，與ABA和細胞分裂素合成途徑相關的基因，包括IPT、CKK、AHK、PYL的表達存在顯著差異。

3.FhRWP在柑橘多種組織繁殖中的多效性

多項實驗結果表明，FhRWP在協調細胞命運和啟動植物再生和繁殖過程中起著關鍵作用，因此，該研究對腋芽MO/PO胚珠的表達數據進行了整合的轉錄組分析。差異基因在花器官發生和繁殖相關的生物過程顯著富集，其中來自MADS和WOX等基因家族的轉錄因子，包括FhWUS和FhAGL6，均顯著富集，在過表達的愈傷組織中，共鑒定出354個差異表達的轉錄因子，GO注釋顯示與胚胎后發育和再生相關的過程顯著相關。值得注意的是，屬于GRF和TALE等基因家族的轉錄因子，包括FhAHT1和FhGRF1，表現出顯著的富集，這些基因已被廣泛報道參與光形態建成、葉片發育等信號通路。

同時，作者在Mo和PO胚珠中發現了56個差異表達的轉錄因子，它們與分生組織維持和胚胎后發育相關的過程顯著相關，其中，來自NAC、NAC等基因家族的轉錄因子，包括FhNAC等轉錄因子顯著富集。此外，還發現了另一個與柑橘核細胞胚發育密切相關的轉錄因子FhC2H2，這些基因參與了傷口的愈合、再生和繁殖，研究結果表明，FhRWP可能是一個關鍵的調控樞紐，通過調節下游轉錄調控網絡和影響各種組織來影響植物的再生。

思路發散

該研究從ATAC-seq入手，先從特異性及差異開放區域相關基因中篩選出來部分目的基因，再結合轉錄組基因表達以及大量基因編輯逐步完善FhRWP調節柑橘繁殖中的多效性，與直接從轉錄組入手篩選基因相比，初篩的基因范圍可能會更小，更利于進一步鎖定關鍵基因，為后續其他研究提供了新的思路。

參考文獻：

Song X, Wang N, Zhou Y, Tian X, Xie Z, Chai L, Wu X, Xu Q, Zhang F, Ye J, Deng X. Adventitious embryonic causal gene FhRWP regulates multiple developmental phenotypes in citrus reproduction. Plant J. 2024 Aug;119(3):1494-1507. doi: 10.1111/tpj.16870. Epub 2024 Jun 16.